友康生物
2026-05-15
公司热点采用相同流程与试剂培养脐血来源的NK细胞，不同样本的扩增结果却有明显差异。问题的根源往往不在操作层面，而在于样本本身的生物学质量差异——这种差异从采集那一刻就已开始。
针对质量欠佳的样本，直接废弃成本过高。一个经过充分验证的策略是：分离单个核细胞后立即冻存，将扩增潜力完整保留，待后续条件适宜时集中培养。
本文从样本采集源头开始，系统阐述脐血样本的质量控制标准，并提供针对特殊样本的冻存解决方案及性能数据。
一、样本采集与初始处理
本章讲述采集阶段应如何操作，以保证样本符合基本要求。
1、抗凝剂的选择
NK细胞的激活依赖于钙离子介导的信号转导过程，因此抗凝剂不得螯合钙离子。
不同于外周血样本使用的肝素钠或肝素锂抗凝的采血管（绿色管盖）。脐血样本应使用枸橼酸钠抗凝的采血袋，推荐采用100mL规格。若仅能获得200mL采血袋，需预先取出14mL抗凝剂，以调整抗凝剂与血样的最终比例。
禁止使用EDTA抗凝（紫色管盖）。EDTA作为强效络合剂，能与钙离子发生螯合作用，阻断NK细胞的信号转导通路，从而抑制细胞活化和增殖。
2、抗凝剂比例的采集后调控
采集后应立即计算抗凝剂在全血中的体积占比（通常为10%至40%），该比例直接影响培养策略：
低于10%：易形成微小凝块，血小板和纤维蛋白释放抑制因子，影响扩增。
10%至20%：理想范围，培养成功率显著提高。
20%至30%：可接受。在此范围内抗凝剂浓度已偏高，不建议大规模培养。
超过30%：扩增效果明显下降，不建议大规模培养，且要考虑改用血替培养。
对于大规模培养（如12-24L体系），建议将抗凝剂比例控制在15%以下。
注：本文默认培养体系采用无血清培养基，血替仅作为抗凝剂比例偏高时的补充选项。
3、保存与运输
采血后应尽快处理。保存温度需控制在4℃（严禁结冰），最好在采血后8小时内送达实验室进行分离，最长保存时间不应超过24小时。
若无法在24小时内完成分离培养，不应将全血直接冷藏，可先进行Ficoll分离、获取单个核细胞后冻存。后续解冻培养的效果不逊于新鲜细胞，部分案例中甚至更优。
二、样本质量评估
收到样本后，实验室需要按照以下步骤逐项检查。首先复核第一部分提到的关键信息，然后评估其他质量指标。
1、复核抗凝剂与运输情况
抗凝剂类型：确认非EDTA，脐血应为枸橼酸钠。
抗凝剂占比：重新计算或核对采集时记录的比例，按照第一部分第2节的四档标准（<10%、10%-20%、20%-30%、>30%）判断是否在可接受范围内。
运输温度与处理时限：查看温度记录仪，计算从采血到接收的时间。理想条件不超过8小时，可接受底限不超过24小时。
2、红细胞占比（单个核细胞悬液中裂解前后对比）
Ficoll分离后，取少量单个核细胞悬液进行红细胞裂解处理，对比裂解前后的细胞状态，评估红细胞残留情况。
常规培养（2-3L体系）：没有溶血，红细胞占比50%以下（参考裂解红细胞前后的对比）。
大规模培养（12-24L体系）：没有溶血，红细胞比例30%以下（参考裂解红细胞前后的对比）。
出现溶血时，无论红细胞占比高低，均不建议直接培养。 血红素对NK细胞具有显著毒性。
3、粒细胞占比（在单个核细胞中的占比）
粒细胞占比是判断样本新鲜度的关键指标（脐带血保存时长的重要指标）：
保存24小时以内的脐带血，粒细胞占比通常低于40%；
保存8小时以内的脐带血，粒细胞占比通常低于20%。
因此，粒细胞占比越低，通常提示样本越新鲜，培养成功率越高。对于大规模培养（12-24L体系），最好采用粒细胞占比低于20%的新鲜样本。
4、NK初始占比（CD3⁻CD56⁺）
不同脐血样本的NK初始占比差异较大（<3% ~ >10%）。经验证，采用友康无血清培养体系培养，无论初始占比高低均可获得稳定的NK扩增产量及纯度。
5、其他注意事项
微生物检测（细菌、真菌，支原体）：必须为阴性，阳性样本直接废弃。
病毒检测：HIV、HBV、HCV必须为阴性，阳性样本直接废弃。
采血体积：常规采血袋规格为100mL或200mL，实际采集体积通常为60至120mL。若低于50mL，即使其他指标正常，起始单个核细胞数量也可能不足以支撑目标产量。可从小体积开始培养，逐步放大。
不同来源的样本不能混用。
三、样本分类与特殊样本冻存方案
1、正常样本 vs 特殊样本对比表
正常样本：满足上表常规培养条件的2-3L体系培养，基本可保证获得100亿以上NK细胞；满足大规模培养条件的样本，做大规模培养基本没问题。
特殊样本：任意一项指标不满足上表对应培养体系的正常样本要求，可以先小试验证再进行培养。尤其是当红细胞比例较高时，应避免使用ACK裂解液或二次Ficoll处理，因为每增加一次处理，细胞损失都会显著增加。可考虑冻存处理单个核细胞，复苏后可通过洗涤去除红细胞及其裂解释放的毒性物质，避免直接培养时的持续损伤。
2、从冻存到培养的完整方案
冻存方案
对于选择冻存处理的特殊样本，推荐使用友康单个核细胞冻存液2.0（rHSA）进行冻存，后续集中解冻培养。
产品优势
以重组人白蛋白为基础，无血清、无人源及动物源成分，安全性更高。
全新升级配方，复合型保护体系，抑制冰晶能力更强，氧化损伤更低，细胞回收率更高（＞80%），复苏后功能可恢复至新鲜组的90%以上。
成品冻存液，无需添加其他成分，可直接使用，且支持2E7 cells/mL高密度冻存。
针对脐血正常样本与特殊样本的实测数据
脐血CBMC经短期冻存后，扩增培养20天，NK表型纯度均＞90%，优于新鲜组。
正常样本培养密度超4E6/mL，特殊样本亦超2.8E6/mL，且友康冻存液在特殊样本中表现优于新鲜组与竞品。
培养方案
友康超纯系列NK套装针对不同规模的NK细胞培养提供完整解决方案：
全新升级新一代免疫细胞修复培养基2.0，在 1.0版本修复受损细胞的基础上，2.0版添加血浆修复因子，支持细胞和血浆双重修复，对于长时间运输、抗凝剂比例过高或冻存质量未知的样本，提供更高的容错率，更稳定的培养结果。
搭配免疫细胞无血清培养基5.0 ，大幅提升了连续 7 天培养后的细胞持续扩增能力，连续 14 天的细胞平均扩增倍数超过1000倍，细胞生长速度更快，收获数量更多。
相较于传统方法，对初始采血量要求更低，仅需5mL脐带血即可启动培养，显著降低供体负担。
逼近99%的超高阳性率，且能维持NK细胞高杀伤毒性能力，保证培养结果的稳定性和一致性。
本套装支持1L、2L、6L、12L、30L不同规格培养方案，样本量跨越5mL-80mL，细胞数量跨域25亿-1000亿，真正做到从实验室到工业化生产规模的按需选择！
